Klinická farmakologie a farmacie – 2/2020

www.klinickafarmakologie.cz  / Klin Farmakol Farm 2020; 34(2): 56–62 / KLINICKÁ FARMAKOLOGIE A FARMACIE 57 HLAVNÍ TÉMA Laboratorní metody v terapeutickém monitorování léků na příkladu radioimunoanalýzy inzulinu (3). Za tento počin získali mnoho vědeckých ocenění, které se v roce 1977 završilo Nobelovou cenou pro R. Yalowovou. Vstup imunoanalytických me­ tod umožnil poměrně jednoduchou a přesnou kvantifikaci látek, které se doposud nedaly sta­ novit, anebo se používaly metody velmi pracné a méně přesné. Imunoanalytické metody se po­ stupně rozšířily za hranice endokrinologie a za­ čaly se využívat v biochemii, imunologii a také v TDM při stanovení koncentrace léčivých látek. Základemvšech imunoanalytickýchmetod je reakce antigenu s protilátkou, z nichž jedna složka (častěji antigen‑léčivá látka) je označena tak, aby mohlo dojít k následné identifikaci volné a vázané frakce. Protilátky jsou imunoglobuliny, které vy­ kazují specifickou vazebnou aktivitu k antigenu, proti kterému byly připraveny. Protože léčiva patří mezi nízkomolekulární látky (tzv. hapteny), mo­ hou vyvolat imunitní reakci a tvorbu protilátek jen když jsou navázány na bílkovinný nosič. Protilátky mohou být polyklonální nebo monoklonální a jejich kvalita významně ovlivňuje specificitu a selektivitu imunoanalytických metod. Imunoanalytické metody se v podstatě dělí na heterogenní a homogenní podle toho, zda se musí před vlastním měřením vázaná a volná frakce antigenu oddělit (heterogenní), anebo zda separace vázaného imunokomplexu není nutná a celý proces proběhne tzv. v jedné zku­ mavce (homogenní). Dále se dělí na kompeti­ tivní (kdy dochází k soutěži o protilátku/antigen) a nekompetitivní s protilátkou/antigenem v nad­ bytku většinou navázanou na vhodný nosič. Kvantifikace dané látky je pak umožněna buď měřením koncentrace označeného imunokom­ plexu, který vzniká v rovnováze mezi značeným a neznačeným antigenem nebo stanovením koncentrace volného značeného antigenu. V obou případech se jedná o nelineární závislost. Mezi první imunoanalytické metody patřila radioimonoanalýza (Radioimmunoassay RIA), kdy se k označení antigenu/protilátky používal radio­ nuklid, především jód 125 nebo jód 131. Později se hledal jiný způsob značení, který byméně zatěžo­ val životní prostředí než radioizotopy. Vznikly první enzymoimunoanalýzy (Enzymoimmunoassay EIA), které k označení antigenu nebo protilátky použí­ valy enzymy jako je alkalická fosfatáza, křenová peroxidáza, beta‑galaktozidáza, glukózo-6-fosfát dehydrogenáza apod. Mezi prvními byla hete­ rogenní kompetitivní enzymová imunoanalýza ELISA s enzymem peroxidázou (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), kde se detekce imuno­ komplexu prováděla fotometricky za vzniku barev­ ného produktu. Mezi další heterogenní imunoana­ lýzy patří enzymová analýza na mikročásticích (Microparticle Enzyme Immunoassay, MEIA) která používala ke značení alkalickou fosfatázu a k detek­ ci fluorescenční methylumbelliferon. Dále se vyvíjely především homogenní kom­ petitivní enzymové imunoanalýzy jako EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassy Technique) s glukózo-6-fosfát dehydrogenázou, kde se spek­ trofotometricky v UV oblasti detekovala měnící se koncentrace NADH. Další homogenní imu­ noanalýzou byla v analytice léků poměrně rozší­ řená polarizační fluoroimunoanalýza (Polarisation Fluorescence Immunoassay FPIA) s beta galak­ tozidázou a s fluoresceinem. Měřila se změna v polarizaci emitované fluorescence po vytvoření imunokomplexu (4). K dalším významným imunoanalytickým metodám na stanovení léků patří metody lu­ miniscenční (Luminiscence Immunoassay LIA), které mohou pracovat na principu chemilumi­ niscence nebo elektrochemiluminiscence. Mezi první typ patří heterogenní chemiluminiscenční imunoanalýza (Chemiluminescent Microparticle Immunoassay, CMIA), kde je antigen označený akridinium esterem a protilátka je vázána na pa­ ramagnetické částice v pevné fázi. Měří se kvan­ titativní množství světla emitovaného během oxidace peroxidu vodíku v alkalickém prostředí. Dalším typem je elektrochemiluminiscenční imu­ noanalýza (Electro‑chemiluminescence immu­ noassay ECLIA). Antigen je označen rutheniovým komplexem a protilátka je obvykle vázána na mikročástice, které se zachytí na povrchu elektro­ dy. Po vložení napětí na elektrodu dochází k emisi světla, která je úměrná koncentraci analytu (5). V současnosti patří mezi rozšířené imu­ noanalytické metody takové, které využívají k detekci imunokomplexu nefelometrii nebo turbidimetrii. Imunoanalytické metody se často používají pro rutinní stanovení koncentrace léčiv vzhledem kmožnosti automatizace, rychlosti analýzy a velké průchodnosti vzorků. Soupravy činidel spolu s pří­ strojovou technikou (automatickými analyzátory) jsou dodávány celou řadou firem především pro nejčastěji monitorované léky, jako jsou antiepi­ leptika první a druhé generace, digoxin, teofylin, vankomycin, aminoglykosidová antibiotika a imu­ nosupresiva. Tab. 1.  Přehled metod používaných pro TDM látka Fotometrie Fluorescence Luminiscence Imuno turbidimetrie HPLC LC-MS/MS digoxin 21 214 122 gentamicin 28 20 47 143 teofylin 19 15 47 104 4 9 kofein 10 7 karbamazepin 28 15 78 106 9 7 ethosuximid 44 19 fenobarbital 15 8 34 69 32 8 fenytoin 18 12 45 71 27 8 primidon 44 17 valproát 98 20 89 89 cyklosporin A 7 113 57 takrolimus 95 61 sirolimus 29 63 everolimus 5 9 64 Údaje z prvního cyklu EHK RfB (Referninstitut fur Bioanalytik) pro rok 2019 CS1/19 a AK1/19. V tabulce je uveden přehled používanýchmetod a počty analýz pro jednotlivé léčivé látky. Zastoupení jednotlivých firem: Fotomerie (Roche, Becman Coulter, Siemens), Fluorescence (Roche), Luminiscence (Abbot, Roche, Siemens), Imunoturbidimentrie (Abbot, Bec- man Coulter, Roche, Siemens), HPLC (Chromsystems, Recipe, vlastní), LC.MS/MS (Chromsystems, Recipe, vlastní)