Klinická farmakologie a farmacie – 2/2020

www.klinickafarmakologie.cz  / Klin Farmakol Farm 2020; 34(2): 56–62 / KLINICKÁ FARMAKOLOGIE A FARMACIE 59 HLAVNÍ TÉMA Laboratorní metody v terapeutickém monitorování léků dělení spolupodílí detergenty např. dodecylsíran sodný. K detekci se používají UV/VIS detektory, elektrochemické a laserem indukované fluores­ cenční detektory a v poslední době i hmotnostní detektory (13). Citlivá vodivostní detekce se provádí u izotachoforézy (ITP) založené na separaci iontů ve stejnosměrném elektrickém poli (14). I když elektromigrační metody představují standardní analytický přístup, mají omezené ru­ tinnímu použití. Testovaly se pro stanovení antie­ pileptik, benzodiazepinů, některých psychofar­ mak, diklofenaku a vybraných beta‑blokátorů (13). Chromatografické metody Chromatografické metody mají při analýze léčivých látek významné zastoupení. Jednotlivé chromatografické techniky se vyvíjely postupně a vždy ve své době představovaly významný po­ krok. Na počátku to byla tenkovrstevná chromato­ grafie (Thin Layer Chromatography, TLC) a plynová chromatografie (Gas Chromatography, GC), které dosáhly svůj vrchol ještě před rozšířenímkapalino­ vé chromatografie a v současnosti je jejich využití jen okrajové. Vysokoúčinná kapalinová chromato­ grafie (High Performance Liquid Chromatograhpy, HPLC) s různými typy detekce se začala rozvíjet od šedesátých let minulého století a v současnosti je topředevšímultraúčinná kapalinová chromatogra­ fie (UHPLC) s hmotnostní detekcí (Mass Detection, MS), která se stala zlatým standardem při analýze léčivých látek. Tenkovrstevná chromatografie Tenkovrstevná chromatografie má své stálé místo v toxikologii při identifikaci léčivých látek. Po nanesení analyzované látky a standardu na start destičky pokryté stacionární fází se chroma­ tografická destička vloží do vyvíjecí komory, která obsahuje směs rozpouštědel (mobilní fázi) a pone­ chá ze zde tak dlouho, až rozpouštědlo dosáhne čelo destičky. Po dokonalémvysušení se jednotlivé látky detekují buďpodUV lampounebona základě barevné reakce s různými činidly. Hodnota RF (po­ měr vzdálenosti skvrny od startu a vzdálenosti čela rozpouštědel od startu) a barevná reakce jsou pro jednotlivé látky charakteristické a dokážou vmno­ ha případech jednoznačně identifikovat danou noxu i bez použití instrumentální techniky (15). Plynová chromatografie Plynová chromatografie (GC) se při analýze léčiv začala uplatňovat od 60. let minulého století pro látky, které se daly při vysoké teplotě převést do plynného stavu, popř. tyto vlastnosti získaly chemickou reakcí tzv. derivatizací. Většinou se pracovalo v módu rozdělovací plynové chroma­ tografie (Gas Liquid chromatography, GLC), kde k separaci jednotlivých látek dochází na základě interakcí mezi stacionární fází (tenkou vrstvou kapalné fáze navázanou na nosič) a analytem. Jako mobilní fáze se používají plyny, nejčastěji dusík, hélium nebo vodík a detekce se provádí buď plamenově ionizačním detektorem (FID) nebo se používá upravená tryska s navázaným alkalickým kovem AFID nebo termionický de­ tektor, oba se zvýšenou citlivostí na přítomnost dusíku a fosforu. Z počátku se používaly náplňové kolony, což byly skleněné nebo kovové trubice plněné stacionárními fázemi. Později to byly ka­ pilární kolony dlouhé až několik desítek metrů s tenkým filmem stacionární fáze nanesenýmna vnitřní straně kapilární kolony, které jsou spojené především s hmotnostními detektory. Metoda GLC se používala hlavně pro stano­ vení antiepileptik první a druhé generace jako je kyselina valproová, fenytoin, fenobarbital, primidon a karbamazepin, ale dá se použít i pro topiramát, který představuje antiepileptikum třetí generace (16, 17, 18). Pracuje se s náplňovými kolonami se stacionárními fázemi na bázi polysiloxanu nejčas­ těji OV-17 nebo SE-30 a s dusíkem jakomobilní fází. Kyselina valproová se stanovuje přímo na fázi SP- 1000. U ostatních antiepileptik, která jsou tepelně nestálá, se prováděla on column derivatizace za vzniku metylderivátů a jako derivatizační činidlo se používal tetramethylamonium hydroxid nebo Minutes 0 5 10 15 20 35 30 25 20 15 10 5 0 1.729 PEMA 2.387 PD mV or mAU 3.593 PB 4.263 LAM 6.270 EPO-CMZ 6.996 IS 12.425 DPH 14.789 CMZ -5 Obr. 2.  Analýza antiepileptik metodou HPLC s UV/VIS detekcí Analýza antiepileptikmetodou kapalinové chromatografie s UV/VIS detekcí (PD – primidon, PB – fenobarbital, LAM– lamotrigin, IS – vnitřní standard, DPH – fenytoin, CMZ – karbamazepin a dva aktivní metabolity PEMA – phenyethyl- malonamid a EPO-CMZ-epoxy-karbamazepin)