Klinická farmakologie a farmacie – 2/2020

KLINICKÁ FARMAKOLOGIE A FARMACIE / Klin Farmakol Farm 2020; 34(2): 56–62 /  www.klinickafarmakologie.cz 60 HLAVNÍ TÉMA Laboratorní metody v terapeutickém monitorování léků trimethylphenylamoniumhydroxid. V praxi to pro­ bíhalo tak, že po extrakci léčiva do organického roz­ pouštěla, nejčastěji éteru se éter odpařil, k odparku se přidal roztok derivatizačního činidla a vzorek se aplikoval na kolonu. Reakce pak proběhla přímo při nástřiku za vysoké teploty (16). Na obr. 1 je uveden příklad analýzy antiepileptik. V současnosti se plynová chromatografie s hmotnostní detekcí používá předevšímpři toxiko­ logické analýze. Ponástřiku extraktů z biologického materiálu na kapilární kolonu a následnou separaci se hmotnostní spektra jednotlivých látek porovná­ vají s knihovnami spekter léčivých látek a dokážou poměrně průkazně identifikovat neznámé léčivo. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je v současnosti nejrozšířenější chroma­ tografickou metodou. Je to separační technika, která využívá kontinuální opakování rovnovážné distribuce mezi pevnou (stacionární) a kapalnou (mobilní) fází. Mezi základní instrumentální vy­ bavení patří vysokotlaká pumpa se zásobníky na mobilní fázi, dávkovací zařízení spojené větši­ nou s automatickým dávkováním vzorků (auto­ sampler), kolona, detektor a zařízení na záznam a zpracování signálu (chromatografický software a počítač). Pumpymohou pracovat v izokratickém (stejné složení mobilní fáze) nebo gradientovém módu, kdy dochází v průběhu každé analýzy ke změně složení mobilní fáze ve prospěch organic­ ké složky a tím k urychlení separace složitějších směsí látek. Kolony představují kovové trubice nejčastěji o délce mezi 5–25 cm a vnitřním prů­ měru 1, 2.1, 3, 4.6mm, které jsou plněné sorbenty s velikostí částic 1.7, 2.6, 3, 5, a 7 µm. Na zpracování signálu v eluátu z chromatografické kolony se mohou použít různé typy detekce, podmínkou je, že musí poskytovat odezvu úměrnou kon­ centraci přítomných látek. Nejčastěji se používají spektrofotometrické UV/VIS detektory, které pra­ cují v oblasti ultrafialového a viditelného spektra (200–600 nm) a hmotnostní detektory na prin­ cipu trojitého kvadrupólu. Detektory fluoromet­ rické nebo elektrochemické se v analytice léků využívají jen okrajově. Nejprve se v kapalinové chromatografii použí­ valymetody s polárními stacionárními fázemi před­ stavované silikagelema nepolárními mobilními fá­ zemi jako je pentan, hexan, chloroformapod. Tento typ se při analýze léčivých látek příliš neprosadil a k významnějšímu použití došlo až s rozvojem techniky nepolární stacionání fáze tzv. reverzní fáze, kdy se na hydroxylové skupiny silikagelu na­ vázaly uhlovodíkové řetězce C8 (oktyl) nebo C18 (oktadecyl), popř. fenyl nebo skupiny CN a NH2, které změnily významně jeho vlastnosti. Zbývající volné OH skupiny, kde už vazba nebyla ze sféric­ kých důvodů možná, byly často ještě upraveny např. trimethylmonochlorsilanemtak, aby se zabrá­ nilo chvostování separovaných látek. Jakomobilní fáze se pak používá voda, popř. pufry, acetonitril, metanol, tetrahydrofuran a jejich kombinace. Pro zlepšení a zrychlení separace se domobilních fází přidávají v nízké koncentraci modifikátory jako je triethylamin, octan amonný, mravenčan amonný nebo se upravuje pH (19). Běžné úpravy biologických vzorků (séra, plasmy, popř. plné krve) před vlastní analýzou zahr­ nují precipitaci proteinů (PPT) acetonitrilemame­ tanolem, extrakci na tuhé fázi (SPE) nebo extrakci z kapaliny do kapaliny (LLE) za použití organických rozpouštědel jako je éter, chloroform, dichlórmetan a toluen. Po extrakci se organické rozpouštědlo odstraní, odparek se rozpustí ve vodě nebomobilní fázi a nastřikuje se na kolonu. Protože u většiny ex­ trakčníchmetod dochází ke ztrátám analyzované látky (extrakční výtěžek bývá ideálně 80–95 %, ale i méně) používají se tzv. vnitřní standardy (internal standard, IS). Jsou to látky strukturálně blízké sta­ novovaným léčivům s podobnými vlastnostmi, které se přidávají ke vzorku před extrakcí a jsou podrobeny stejným postupům jako stanovova­ ná látka. U HPLC s UV/VIS detekcí musí být jejich retenční čas odlišný v porovnání s analyzovanými léčivy, u kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí (LC‑MS/MS) se jako vnitřní standardy čas­ to používají stejná léčiva jen izotopově značená např. deuteriem (meropenem a meropenem d6) a jejich retenční čas je totožný. (19, 20) HPLC s UV/VIS detekcí se používá při analýze léčivých látek ve všech farmakologických skupi­ nách. Jsou to např. antiepileptika včetně farma­ kologicky aktivních metabolitů, teofylin, kofein methotrexat, amiodaron a desethyl- amiodaron, benzodiazepiny apod. (21, 22, 23, 24, 25). Příklad analýzy antiepileptik je uveden na obr. 2. Kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí Kapalinová chromatografie s hmotnostní de­ tekcí je založena na separaci a stanovení látek na základě poměru jejich hmotnosti a náboje (m/z). Každý hmotnostní spektrometr se skládá ze tří základních částí - iontového zdroje, analyzátoru a detektoru. V iontovém zdroji dochází k ionizaci molekul za vzniku pozitivně nebo negativně na­ bitých iontů. Nejpoužívanějšími iontovými zdroji je elektrosprej (ESI) a chemické ionizace (APCI). V analyzátoru dochází k separaci iontů ve vakuu na základě poměru jejich hmotnosti a náboje a do detektoru jsou propouštěny jen ty, která mají odpovídající hodnotu m/z daného skenova­ cího režimu. V detektoru se měří změna signálu např. měřenímzměny elektrickéhoproudu. Při ana­ lýze léčiv se nejčastěji používají trojité kvadrupóly (tandemová hmotnostní spektrometrie, (MS/MS), které jsou vysoce citlivé a specifické. Tyto přístroje jsou složeny ze dvou kvadrupólů, které pracují jako hmotnostní analyzátory. Třetí kvadrupól uložený mezi nimi slouží jako kolizní cela, kde za přítom­ nosti inertního plynu, nejčastěji argonu dochází k fragmentaci stanovované látky. Každá látka je pak charakterizována prekurzorovým (parentním) iontem a specifickými produktovými (dceřinými) ionty a na základě těchto údajů pak může být velmi přesně a specificky kvantifikována. Vzhledem k tomuto způsobu kvantifikace nemusí být jed­ notlivé látky na rozdíl od HPLC s UV/VIS detekcí zcela separovány, což urychluje analýzu složitějších směsí (26). Nutno alemít na paměti, že pokud tato léčiva existují v organismu nejen volná ale i ve formě glukuronidů (např. kyselina mykofenolová) nebo sulfátů (např. cyklosporin A) musí se obě složky chromatograficky oddělit, jinak by došlo k falešnému navýšení koncentrace měřeného lé­ čiva (27). Příklad analýzy kyselinymykofenolové je uveden na obr. 3. Hmotnostní průletové spektrometry (Time of Flight, TOF) s vysokým rozlišením se ve spojení s kapalinovou chromatografií používají v toxikologii a v metabolomice při studiu metabolitů léčivých látek (26). K úpravě vzorků krve, séra nebo plazmy se u hmotnostní detekce nejčastěji používá precipitace metanolem nebo acetonitrilem, popř. jejich kombinace a také se přidává síran zinečnatý nebo jiná aditiva pro zvýšení účin­ nosti (28). Protože precipitace úplně neodstra­ ní příměsi doprovodných složek přítomných v biologických vzorcích jako jsou endogenní fosfolipidy nebo aditiva heparin a EDTA, musí se tyto extrakty testovat na tzv. matricový efekt (29, 30). Ten se zjistí porovnáním plo­ chy píku stanovované látky bez a po přidání