Klinická farmakologie a farmacie – 2/2020

www.klinickafarmakologie.cz  / Klin Farmakol Farm 2020; 34(2): 56–62 / KLINICKÁ FARMAKOLOGIE A FARMACIE 61 HLAVNÍ TÉMA Laboratorní metody v terapeutickém monitorování léků extraktu matrice (séra popř. krve) a rozdíl by neměl být vyšší než ± 15 %. V opačném pří­ padě by mohlo dojít k významnému ovlivnění výsledku analýzy. Matricový efekt se dá snížit několika způsoby: používat co nejmenšího množství aditiv přítomných v odběrových sys­ témech (pokud je to možné pracovat se vzor­ ky séra), používat izotopově značené vnitřní standardy, které eluují ve stejném retenčním čase jako analyzované látka a pracovat v níz­ kých koncentracích, kde jsou matricové efekty významně nižší (31). Metoda LC-MS/MS se používá při stanovení léčivých látek a jejich aktivních metabolitů ze všech farmakologických skupin. Jsou to pře­ devším antiepileptika, psychofarmaka, imu­ nosupresiva, antihypertenziva, antimykotika, antivirotika a antibiotika (32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 20). Hmotností detekce umožnila přímo stanovovat i takové látky, které ve své molekule nemají chromofory, což jsou skupiny atomů, které umožňují absorpci světla. Tyto látky se při měření metodou HPLC s UV/VIS detekcí muse­ ly nejprve převést na barevné produkty che­ mickou reakcí tzv. derivatizací, což bylo časově náročné a nevhodné pro rutinní použití (40). Mezi takové látky patří např. topiramát, gab­ apentin a vigabatrin ze skupiny antiepileptik a celá skupina aminoglykosidových antibiotik, jako je amikacin, gentamicin a tobramicin, pro které se dříve výlučně používaly imunoanaly­ tické metody. Ty se většinou vyvíjely v době, kdy se aminoglykosidová antibiotika podávala 3× denně v nižších dávkách s dosažením nižších vrcholových koncentrací, než je tomu u součas­ ného podávání jednou denně. Tato skutečnost často vede k vysokým píkovým koncentracím antibiotik, které se nacházejí nad rozsahem ka­ libračních křivek komerčních imunoanalytických metod, a proto se musí tyto vzorky často ředit a měření opakovat. LC‑MS/MS má výhodu v na­ stavení optimálních podmínek analýzy např. roz­ sahu kalibračních křivek a umožňuje celkově nižší náklady na analýzu při zachování podobné průchodnosti vzorků (41). Validace chromatografických metod Chromatografické metody se většinou vy­ víjejí individuálně pro jednu nebo více léči­ vých látek z dané farmakologické skupiny vždy na základě požadavků z klinických pracovišť. Označují se jako „home made“ metody a musí se před zavedením do rutinní praxe validovat podle FDA (Food and drug administration) kritérií. Mezi požadované validační parame­ try patří linearita, opakovatelnost, mezileh­ lá preciznost, kvantifikační a detekční limit. Opakovatelnost a mezilehlá preciznost se stanoví na základě měření 10 vzorků připra­ vených nejméně ze tří různých koncentračních hladin a měřených buď během jednoho dne (opakovatelnost) nebo v průběhu několika ná­ sledujících dnů (mezilehlá preciznost). Variační koeficienty (VK) musí být do ± 15 % a jed­ notlivé koncentrace látek se musí pohybovat mezi 85–115 % nominální hodnoty. Pracovní rozsah měření je dán lineární závislostí mezi nejnižším a nejvyšším bodem kalibrační křiv­ ky. Kvantifikační limit je nejnižší koncentrace (obvykle nejnižší bod kalibrační křivky), která se dá měřit s akceptovatelnou chybou s VK do ±20 % a koncentrací mezi 80–120 % no­ minální hodnoty. Kvantifikační limit a detekční limit se dají odečíst i z chromatografického záznamu porovnáním s rozkmitem nulové linie jako 10S (kvantifikační limit) a 3S (de­ tekční limit). Součástí validace je testování selektivity a robustnosti chromatografických podmínek a u metod s hmotnostní detekcí se testují matricové efekty vždy cíleně pro daný typ matrice jako je sérum, plasma, likvor nebo např. mateřské mléko. V rámci validace se zjišťuje stabilita jednotlivých analytů a tyto poznatky se využívají při transportu vzorků a během celé preanalytické fáze (42, 43). HPLC i LC‑MS/MS metody jsou v součas­ nosti dostupné i ve formě komerčně dodá­ vaných diagnostických souprav, které osahují vše potřebné k provedení analýzy, jako jsou kolony, standardy, mobilní fáze a pracovní po­ stupy. Pracoviště musí být vybavena pouze vhodnou instrumentální technikou. Takovéto metody, podobně jako ostatní komerčně do­ stupné metody jsou plně validovány výrobcem a jejich diagnostické soupravy bývají označeny značkou CE. Závěr Z celé škály analytických metod se v TDM nejčastěji používají metody imunoanalytické a metody kapalinové chromatografie s UV/VIS detekcí nebo s hmotnostní detekcí, která se stala zlatým standardem při analýze léčivých látek. Imunoanalytické metody se používají především pro TDM déle monitorovaných lá­ tek jako je digoxin, aminoglykosidová antibio­ tika, vankomycin, teofylin a antiepileptika první a druhé generace. U antiepileptik se poprvé začaly používat chromatografické metody, které Obr. 3.  Analýza kyseliny mykofenolové a jejich metabolitů metodou LC-MS/MS Chromatogram kyseliny mykofenolové a jejich dvou metabolitů metodou kapalinové chromatografie s hmotnost- ní detekcí. 7-OH glucuronid (RT 0,79), acylglukuronid (RT 0,99), MPA – kyselina mykofenolová (RT 1,30)